Ο Aleix Espargaro της Aprilia Racing άνοιξε τον ρυθμό στο ζέσταμα των MotoGP για το Gran Premio d'Italia Oakley. Ενώ οι Ducati κυριάρχησαν στις κατατακτήριες στο Autodromo Internazionale del Mugello, οι αντίπαλοί τους από το εργοστάσιο της Noale έκαναν το 1-2 στην τελευταία περίοδο δοκιμών πριν από τον αγώνα. Ο Espargaro και ο ομόσταυλός του, Maverick Viñales, πέρασαν μεγάλο μέρος του ζεστάματος κάνοντας μαζί τους γύρους τους, σημειώνοντας τους χρόνους 1:46.976 και 1:47.116 αντίστοιχα.

Ωστόσο, η Ducati είχε μια ισχυρή παρουσία κοντά στην κορυφή των φύλλων χρόνου. Ο Marco Bezzecchi, ο οποίος θα ξεκινήσει τον αγώνα από την δεύτερη θέση, ήταν τρίτος ταχύτερος με 1:47.223, μπροστά από τον Johann Zarco με 1:47.246. Η Ιαπωνία εκπροσωπήθηκε, όσον αφορά την μοτοσυκλέτα και τον αναβάτη, από τον Takaaki Nakagami στην πέμπτη θέση με 1:47.414, ενώ ο Francesco Bagnaia σημείωσε 1:47.460 για να διεκδικήσει την έκτη θέση, μπροστά από τον Luca Marini που επίσης θα ξεκινήσει από την πρώτη σειρά της εκκίνησης. Πίσω του βρέθηκαν οι δύο αναβάτες της Suzuki, Alex Rins και Joan Mir, ενώ την δεκάδα έκλεισε ο Jack Miller. 

O Marc Marquez ήταν στην 12η θέση, ενώ ο κάτοχος της pole position, Fabio Di Giannantonio έκανε τον 14ο καλύτερο χρόνο. Ο Παγκόσμιος Πρωταθλητής του 2021, Fabio Quartararo ήταν αρκετά πιο πίσω, στην 20η θέση, με τους πρώτους 20 όμως αναβάτες να κινούνται στο ίδιο δευτερόλεπτο.

 Η πίστα είχε κομμάτια που είχαν κρατήσει υγρασία λόγω της βροχής κατά τη διάρκεια της νύχτας, αλλά το ζέσταμα κύλησε χωρίς πτώσεις.